徕卡显微镜通过测量荧光基团分析的离子浓度变化
一个小区的许多基本功能强烈依赖于离子的精巧，但尽管如此动态余额（例如钙，镁），电压电位和细胞的胞质溶胶之间的pH值和周围的细胞外空间。 改变这些余额显著改变细胞的行为和功能。 因此，在实时细胞内离子，电压和pH动力学测量是研究人员在神经科学，细胞生物学和细胞生理学一般巨大的兴趣。 在很多情况下，然而，实际的离子浓度，或在一个小区或蜂窝网络的不同位置的相对变化的确切估计难以用常规的荧光的方法。 其原因是，这些方法没有考虑的事实，即在一个小区的不同的部件或在蜂窝网络中的细胞类型之间的细胞形态的差异可能影响其质量和发射的光的量的帐户。 这可能导致大量的误解当离子浓度，电压或pH值的动态变化进行了研究。 比例的成像技术，通过观察荧光团的发射波长移位或通过比较荧光团组合的发光强度，而不是单纯的测量强度变化绕过这些问题。
离子浓度和pH值或电压变化的通过测量荧光发射的变化估计
研究活动越来越注重识别和时空分布如当地的“热点”中离子浓度，电压或pH值在单元格或蜂窝网络的动态变化。 这样的“热点”常常定位于细胞的专门的部件或在某些细胞中的蜂窝网络中。 此外，相对于试样中细胞代谢或结构方面的其余部分，这些区域通常具有不同的性质。 用于研究动态生理状态的常规荧光在离子结合，pH值的变化或电压变化而变化的排放强度（根据钙结合如荧光4增加了排放）。 然而，这些标记不考虑到在结构，直径或标记的摄取/表达的差异可以引起变化的发射光的那些不与实际的离子浓度，电压或pH值的相关性的量。 定量和同等检测的变化的细胞结构或不同的细胞，不敏感的方法来构造的直径和荧光团浓度是必要的。 而相比之下，非比例成像方法，比率成像提供了机会，可重复地测量绝对细胞内离子，电压和pH水平/改变相对于细胞直径，荧光团浓度和成像设置的光学性质。 但是，比例成像取决于激发波长或检测波长，强烈的光源，光学元件和快速的信号检测的优异的变速器的快速变化。 超快滤光轮，UV光优化的物镜，高度敏感的荧光基团和新的CCD相机的Zui新发展使得在高空间分辨率实惠定量高速活细胞成像。
双波长激发/检测是关键，用于测量荧光团的发射移
徕卡显微镜如上所述，在比率量度摄像的发光转移仅仅强度变化，而不是被成像。为了测量发射的变化，荧光团或荧光团的组合的强度的变化，必须通过使用两种不同的激发波长或者通过检测在两个不同的发射波长或者测量。 在通常使用的钙成像染料FURA-2的情况下，该染料具有被激发的光在340nm和380nm处，检测波长的波长为510纳米。 相反的是，钙成像染料吲-1通常是激发光在350nm的波长和检测波长为405纳米和485纳米。
图1：使用比例钙指示剂Fura-2从钙成像实验的时间推移的快照。 描绘有后340纳米（左）和380纳米（中）的激发和相应计算出的比率的图像（右）假彩色图像。 所述图像系列示出了三个个时刻：在时间的第一点（1）单元，不刺激，细胞内钙离子是在静息水平。 在第二时间点（2）的细胞受到刺激和钙是在Zui大水平。 在时间的第三点（3）的细胞内钙水平下降。 在该曲线图在时间上的对应点被标记。 上部的曲线示出了340nm处的图像的强度，中间的图中的380nm处的图像和下部曲线图中，显示了比强度。
但是，为什么需要双激发或发射检测？ 为什么不能简单地衡量变化的荧光强度？
定其中的荧光团可用于检测改变离子的水平，电压或pH一个实验中，发射的荧光的光的强度取决于几个特性。这些将在下面的方程式所描述：
F =荧光强度; C =荧光浓度; D =直径标本（Z轴）; K =光在光通路组件的常数（单元格属性，物镜，过滤器等）; F（x）的介绍，如果如离子绑定或出现电压/ pH值的变化给定的荧光团的发射行为。
该方程表明，光的强度在很大程度上取决于荧光团在光路中的量。 荧光团在光路中的量取决于荧光团在细胞和样品（D）的直径（通过标记的摄取或表达确定的）（多个）的实际浓度（c）该被成像。 这使得它很难直接通过简单地观察荧光强度，例如，一个不能状态估计一个调查离子，pH水平或电压变化的浓度：“100强度等于游离钙在细胞中的100nM的”。 试样直径（d），荧光团的浓度（c）和检体和设置（K）的光学特性几乎没有可测量的，但基本上影响整体强度检测到。 此外，它必须牢记的是，上面示出的公式为真，在检体任何给定的点。随着直径（d）和荧光团浓度（C）不是均匀的整个一个试样，甚至在单个细胞，对c和d的值可能是在检体的所获取的图像的每一个像素的不同。 如果，例如在点“A”，在样品中的细胞的直径是相当高的和游离钙相当低，光强度可能是同一如在点“B”，它是相对的。 实验者然而，可能错误地得出这样的结论中的钙浓度是在这两个地方相似，因为检测到的荧光的光强度是类似的。
图2：草图上面打算说明如果在小区内如钙浓度由一个非比例钙敏感的荧光团所发射的光的强度来判断可能发生的错误解释。 草图下方的曲线代表光强度的感兴趣区域（ROI）中的细胞的不同部分的区域。
在上部图像（A）中的细胞在不同的区室像细胞突起这往往是精细结构（如树突和神经元的轴突）不同厚度（四中表现公式）。 作为光路内的所有荧光团被激发光激发而其发射的光被收集，细胞的较厚部位出现比薄的部分更亮。 这可能导致的假设，即在细胞中的较厚部分中的钙浓度比可比较薄部分更高，虽然实际的钙浓度是相同的。
在较低的草图（B）不同的情况被示出。 在某些细胞类型的荧光团占据的细胞区室之间可能会有所不同。 在下部草图的情况下，钙浓度（C式中的）中的细胞的较厚部分较高，但在这方面的荧光团浓度较低。 作为钙敏感染料的检测到的荧光强度不仅取决于钙离子浓度在细胞中，而且还对荧光团浓度，人们可能会得到的印象是，在全细胞中的钙浓度是相同的。
为了克服这些问题，并为绝对离子浓度，pH水平或电压的精确测量，比例成像已经被开发出来。 所有比例的方法的共同之处在于发射的光的强度被测量两次且这些强度的比（R）的计算。 取决于荧光团或所用的荧光团的组合，所述荧光团或者是激发光的两个不同波长和发光强度的测量是在一个波长 - 或荧光团或荧光团的组合是激发光1的波长和发射的测量是在两种不同波长的光。 这只是意味着两个灰度值的图像被获取和一比图像从它们算出。 两个灰度值的图像通常有不同的强度，但在图像中的每一个像素的强度可以通过以下所示的公式来描述：(奥林巴斯显微镜)
F =荧光强度; C =荧光浓度; D =直径标本（Z轴）; K =光在光通路组件的常数（单元格属性，物镜，过滤器等）; F（x）的介绍，如果如离子绑定或出现电压/ pH值的变化给定的荧光团的发射行为。
正如其名称比率成像所暗示的，对于两个同时获得的图像的每一个像素的比率值被计算。 例如，如果非常常用的钙敏感染料的Fura-2（激发在340和380纳米）时，所得到的方程是：
根据简单的数学，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述为：
虚拟比例图像从两个灰度值图像计算
在实践中，该比例是由一个计算机在一个时间推移实验计算，在许多情况下，联机。 通过计算相应的两个独立采集灰度值图像的像素的灰度值的比率，该比率图像被创建。 请记住，灰度值的图像基本上都是灰度值与相机分辨率的大小或感兴趣区域（ROI）的区域矩阵（512×512平时，Zui多不超过1000×1000像素）。 在一个钙成像时间推移实验与染料的Fura-2（激发：340纳米和380纳米，发射：510纳米）这会工作如下（假设该图像具有尺寸3×3个像素）：
图3：强度读数值的简化插图CCD照相机可能使用钙探针呋喃-2传递到计算机中的钙成像实验这一点。 在这种情况下，图像将是3×3像素的大小。上部三个矩阵代表在钙浓度静止强度读数值在340 nm和380 nm激发加上相应的比率值。照片下三个矩阵代表在高亮像素时钙的升高的强度值的变化。 在340nm处激发的增加值，而在380nm处激发减小的值。 但是，相对的比例值也将增加。
执行用于每个图像对中一个时间推移实验的每个像素这个操作，产生比图像栈。 Zui后，以假色图可以应用到比图像栈和堆然后可以观看并定量像正常灰度值的时间推移的电影。
除了上面提到的优点，一个比率计算具有附加的优点。 在进行活细胞成像与离子，电压或pH敏感的荧光，荧光强度在相应波长的微小变化经常发生。 在比成像，但是，强度的增加，在一个波长和强度降低，在其它波长是在大多数情况下，观察到的（不管探针是否被激励或具有两个波长检测）。 如果这两个获得的图像的比率随后计算，基线和信号振幅之间的差将相比于荧光团的单纯的强度变化被增强。 因此，比成像放大检测到的信号的幅度。 这是用于FRET测定法特别感兴趣，在那里的受体蛋白质的下降的荧光强度和能量传输期间的受体蛋白的增加的荧光强度。