荧光显微镜自动对焦技术的发展(ZEISS/OLYMPUS/NIKON)

2016-03-25技术资料

    近三四十年来,国内的自动对焦技术研究取得了较大的成就。早在1985年,根据光学自准直成像原理,上海光机所首次将自动对焦技术应用于集成电路光刻机。1986年哈尔滨工业大学同样利用自准直成像原理成功研制了应用于卫星照相机的自动对焦系统,又于1993年利用高分辨率CCD将对焦精度进一步提高。

荧光显微镜自动对焦技术的发展(ZEISS/OLYMPUS/NIKON)

1990年,清华大学利用偏心光束法,实现了自动对焦并应用于线宽测量仪[9]。除此之外,上海激光技术研究所和浙江大学四等研究单位在自动对焦的研究中也取得了一定的成果。但总体来看,国内自动对焦显微镜的产业化程度还比较低,绝大多数光学显微镜依然采用传统的手动对焦方式。
3.2国外研究现状
    相比国内,自动对焦在国外己经发展成一门比较成熟的技术,尤其在数码相机和监控系统方面。不过相较而言,该技术在显微镜中的应用比较少。虽然已经有公司推出了带有自动对焦功能的产品,但是价格十分昂贵。表1-1为Nikon,Olympus和Z eis s三家公司自动对焦方法的对比。
三家光学公司自动对焦方法对比

│    │ZEISS               │OLYMPUS         │NIKON             
│名称Definite Focus        Zero Drift      Perfect Focus System       
│    │                          Compensate                         
│描述自动对焦系统直接连  │进行活细胞观察  │对系统加药时和长时间  
│    │接物镜转换器,将近红│时,这种聚焦飘移│观察过程中可能出现的  
│    │外光(835mn)打入成   │补偿的功能减少  │焦点飘移进行校正,高  
│    │像主光路。将一个格栅│了对于会导致聚  │倍物镜下也可以正常使  
│    │投影到培养皿的底部,│焦模糊的轴亮加  │用,将PSF整合在物镜  
│    │系统通过分析投射光  │图像的需要,同时│转换器上,有助于节省  
│    │经过底部的反射光,检│系统使用光毒性  │空问。该补偿系统可对Z 
│    │测物镜与样品问的距  │较小的785nm激  │轴平面进行实时校正,  
│    │离,从而确定偏移量并│光,因此不需要关│不需要使用时,也可以  
│    │快速而精确的校正到  │注荧光衰减。    │简单的将其撤出光路。  
│    │焦点。        
│特点│测准光采用LED,不  │二者工作原理相似,均通过红外或近红外激  
│    │会干扰荧光样品的激  │光检测焦面的变化。工作前需要人工调整到  
│    │发和发射光谱,但是配│准焦位置,并记住该位置,当Z轴的变化超  
│    │置复杂,价格昂贵。  │出一定范围时,系统会自动回到该位置。    

    事实上,根据工作原理,上述三种自动对焦方式(均为硬件对焦)都不是真正意义上的自动对焦,更准确的说法是焦面定位,只能检测到样品表面相对基准面的偏移量,而并不关注样品本身的性质,当厚度变化的样品移动时,三类产品都不能很好的实现自动对焦。
    本课题所使用的荧光显微镜用于FISH荧光图像的获得,成像样品为内部染色体进行荧光标记后的细胞,样品厚度不断变化且不易测定,因此上述的方法不能很好的实现自动对焦。
4课题研究意义及主要工作内容
    木课题基于兼具目视观察和数字成像的荧光显微镜,提出了目视显微镜和数码显微镜中新的景深计算方法,并针对高倍显微镜景深较小和测试样品的特殊性,提出了基于灰度直方图的对焦评价函数和最佳成像位置的搜索算法。