尼康显微镜三色带通激发块

包括在尼康三色波段激发荧光激发块组合是两个各自包含三个带通发射区能够通过蓝色，绿色，黄色，橙色的窄波段，和红光谱区有选择地分离出荧光发射小心平衡组合。 此交互式教程探索的变化而激发和发射激发块的光谱分布，以及那些的多色镜子，如何影响在设计用于乘法标记的荧光团在三色激发组合信号电平，光谱交叉，整体过滤性能，并且图像对比度紫外线，蓝色和绿色区域。

教程初始化与随机选择的荧光检体中出现的标本图像窗口和紫外线蓝绿三带通激发块激发组合（DAPI-FITC-TRITC;默认）上的过滤器集谱概况图形显示频谱轮廓。 荧光的吸收和发射光谱截面（带过滤器的传输通带重叠区域）可以选择在光谱截面标题中列出相应的复选框（ 吸收或发射 ）单独或集体观看。 当一个或多个复选框被激活，将合并的过滤器的透射和反射光谱叠加在所选择的荧光团（多个）使用以标记样品（荧光光谱图中不包括对自身荧光植物标本）的吸收光谱和发射光谱。 荧光团的吸收光谱示于使用棕色填充的教程，而相应的发射光谱表示用灰色填充。 由过滤器设置滑块显示过滤器组合波长特性，显示在本教程中下部的黑色方形框。 这些值被不断地更新作为滑块被翻译从左至右。

为了操作教程，使用过滤器设置滑块可供三频激发两个过滤器组合之间进行转换。 当滑块从左至右翻译，激发和阻挡滤光片的光谱分布，以及该多色镜，被修饰以模拟变化的光谱分布。需要注意的是连续变化的光谱图并不暗示任何激发块的组合是可能的，也不是单独的过滤器设置可变（没有物理地更换过滤器）的问候的光谱分布。 的选定的过滤器套之间的频谱轮廓的变化被简单地用于帮助建立在每个光学块中使用的过滤器的组合之间的关系。

个别过滤光谱 （激发，发射和多色反光镜）可以通过选择或取消相应的复选框的下面图中添加或删除过滤器设置光谱曲线图。 此外，该荧光团的吸收光谱和发射光谱可以被添加或与一组类似的复选框（ 频谱截面 ）除去。 检体图像同时改变与过滤器配置文件以反映变化由改变通过所述滑块的平移产生的过滤器的组合产生的对比度和信号电平。 新的标本可以在任何时候选择使用选择的样本下拉菜单，用来标记选定样本的荧光直接列出的菜单框的下方。 在所有的情况下，将样品粘有两个或更多荧光探针展示荧光的具有窄的和宽的通带阻（发射）过滤套的选择性分离。

尼康显微镜三色波段荧光集被主要设计用于与特定的三荧光套件Zui佳性能，尽管它们都同样有效用具有类似的吸收和发射光谱曲线候补探针组合。 利用精确的波段选择，具有反射和透射区之间的陡峭的带通转换，多重激发和发射信号分离以Zui小的干扰。 为了保持三个单独的荧光信号波段，这些专门的过滤器组还包含二色镜具有多个带通特性，其具有互补于所采用的具体的激发和发射激发块的传输和反射区域。 每个尼康三波段荧光集优化结合DAPI和FITC（异硫氰酸荧光素）与使用或者TRITC（异硫氰酸四甲），或得克萨斯州红探头。 对应于这些荧光染料的组合相关的频谱区的范围从紫色激发和发射蓝色到绿色的激发和红色发光。

尼康DAPI-FITC-TRITC三色波段激发块组合结合有一个通带为紫色区域的激发（385〜400纳米），连接到一个带通发射（屏障）过滤器发射蓝色荧光（450到465纳米）在其第一激发滤光片（Zui短波长）信号带。 第二个激发 - 发射波长组合，此过滤器集允许蓝色激发在475至490纳米的窄带和检测所产生的绿色荧光，在505至535纳米范围内。 第三荧光信号由绿色区域激发（545至565纳米），其导致橙红色发光，在580至620纳米的波长范围内检测产生的。这套三联荧光带提供Zui佳的同时检测DAPI，FITC和TRITC，专门针对不同的细胞成分; DAPI - Alexa Fluor 488 - MitoTracker Red CMXRos荧光组合是适合这个过滤器设置为好，该Alexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos光谱曲线那些FITC和TRITC的相似性。

在三色激发激发块块，与在其他的多波段套，二色反射镜的设计是至关重要的多个荧光信号的分离，允许其检测具有Zui小交叉（光谱bleedthrough）和噪音。 与此相反的长通分光镜常常在传统的过滤器组合使用时，多波段套采用二色反射镜与被精确地定位相对于所述多个激发和发射波段的带通数的区域。 典型地，第一（下部）切割上的反射镜被定位仅仅几纳米上述短波长激发峰，开始一个传输波段完全围绕相应的发光峰值波长的值，接着是陡峭的透射截止，这允许第二激发带的反射。 在刚刚比第二激发带更高的指定波长，反射镜使另一个尖锐过渡到与所述第二发射带通相对应的发送区域。 在三频段激发块组，该发送反射图案被重复一次的第三信号通道。 在DAPI-FITC-TRITC组合使用二色镜具有适当地位于相对于各个激发和发射激发块互补的多个带通透射区域。 切的波长出现在435，500，和570纳米。（奥林巴斯显微镜）

薄膜干涉技术中的多波段激发块组的制造中的应用使得有可能平衡的两个（或更多）的荧光染料，以提供Zui佳的成像特性的荧光信号水平。 在许多过滤器的组合，所述短波长激发峰的传输特性文件的尺寸减小，以平衡两个或三个发射信号，以及以Zui小化光漂白和标本的损伤。这是在套设计用于与一种荧光团激发的紫光或紫外光谱区，使用特别重要的是由于较短的波长的高激发效率。 短波长激发峰的显著降低强度示于两个尼康三频组合的透射光谱。 它也可以注意到通过检查某些部件是通用的，以一个以上的过滤器块中的过滤器组透射光谱。 例如，双波段FITC-Texas Red和三色波段DAPI-FITC-Texas Red套利用相同的二色镜和发射滤光片，只是在不同的激发激发块组件，其中第三个短波通带被添加为DAPI激发在三联集。

同时检测DAPI，FITC和德克萨斯红（或类似的光谱荧光团），可以很容易地实现与尼康DAPI-FITC-Texas Red三色激发带通激发块组合。 紫色激，蓝色发射激发块波段，和蓝色激发绿色发射带（对应于DAPI和FITC，分别）具有类似的特性对于与DAPI-FITC-TRITC集，虽然有轻微的修改与更好的集成德克萨斯红，绿的激发的红色发光的光谱特性发生在较高波长相比TRITC。 在这一组中使用的激发滤光片具有395至410纳米（紫色激发）联接到450至470纳米的发射（阻挡）激发块的通带（蓝色发光），这是适合于DAPI和类似的荧光团1带通区域。激发块组的第二波段提供激发在490至505纳米的蓝色波长范围内，并且检测在515和545纳米之间的范围中相应的绿色发光的（用于FITC和类似的荧光染料）。 对于德克萨斯红荧光优化信道具有560至580纳米（绿色激发），耦合到一个发射带在600至650纳米的红色光谱区域中的激发范围。

奥林巴斯显微镜虽然对于DAPI，FITC和德克萨斯红荧光团的三色联合优化，探针具有相似的吸收和发射光谱特性也可以使用与此过滤器集。 相比，DAPI-FITC-Texas Red块，产生出现更多的橙色色调图像中的DAPI-FITC-TRITC块，其中有一个红色发射通带错开15纳米到较低的波长。 该二色镜（分束器），在DAPI-FITC-Texas Red滤光片组合的带通区域的战略位置处的445，510，和590纳米的截止点的波长与激发和发射激发块窗口来对应。 规格为二色镜和滤光片的两个尼康三色波段激发块的组合列于表1。

尼康三频激发过滤组合规格

表1

• DAPI-FITC-TRITC -的DAPI-FITC-TRITC激发块组合被设计成用于同时从具有类似的光谱特性的荧光染料DAPI，FITC和TRITC或其他探针组合检测发射。 三个狭窄的激发和发射谱带对应紫色激发特定区域与相应的橙红色发光蓝色发光，蓝色激发耦合到绿色排放，绿色激发。

• DAPI-FITC-Texas Red -时相比，标准的DAPI-FITC-TRITC集绿色发射， -该DAPI-FITC-Texas Red滤光片组合的设计稍有不同的通带区域为紫色激发-蓝色发射，以及用于蓝色激发。 这种设计是为了更好地与必要的得克萨斯红更高的激发和发射波长，相对于对于TRITC的值符合。 多带通地区的用户提供Zui佳的检测，以Zui小的交叉和噪音，为DAPI，FITC同时可视化和德克萨斯红，或类似的光谱荧光组合。