徕卡显微镜通过测量荧光基团位移分析的离子浓度
一个小区的许多基本功能极大地依赖于离子的微妙的，但尽管如此动态结余（如钙，镁），电压电位和细胞的胞质溶胶中的pH值和周围的细胞外空间。改变这些余额显著改变细胞的行为和功能。因此，在实时的细胞内离子，电压和pH动力学的测量对于研究人员在神经科学，细胞生物学和细胞生理学中一般巨大的兴趣。在很多情况下，然而，实际的离子浓度或在细胞或蜂窝网络的不同位置的相对变化的精确估计很难与传统的荧光的方法。其原因是，这些方法没有考虑以下事实：在一个小区的不同部分或在蜂窝网络中的细胞类型之间的细胞形态的差异可能影响其质量和发射的光的量的帐户。这可能导致重大的错误解释当离子浓度，电压或pH值的动态变化进行了研究。比例的成像技术，通过观察荧光团的发射波长变化或通过比较荧光团组合的发光强度，而不是测量光强度的变化绕过这些问题。
离子浓度和pH值或电压的变化，通过测量荧光团的发射偏移的估计
徕卡显微镜研究活动越来越多地把重点放在确定和时空分布如当地的“热点”中的离子浓度，电压或pH值的单元格或蜂窝网络的动态变化。这样的“热点”通常定位于细胞的专门部件或在某些小区的蜂窝网络中。此外，相比于试样中的细胞代谢或结构方面的其余部分，这些区域通常具有不同的性质。用于研究的动态生理状态的常规荧光团经离子结合，pH值的变化或电压变化而改变其发光强度（对钙结合如荧光4增加排放）。然而，这些标记不考虑在结构，直径或标记物的摄取/表达的差异可以引起变化的发射光的那是不符合实际的离子浓度，电压或pH值的相关性的量。定量和同等检测的变化，蜂窝结构或不同的细胞，不敏感的方法来构造直径和荧光团的浓度是必要的。而相比之下，非比例的成像方法，比率成像提供了机会，可重复地测量绝对细胞内离子，电压和pH值/变化相对于细胞直径，荧光团浓度和成像设置的光学性质。但是，比例成像依赖于激发波长或检测波长，具有强大的光源，光学元件和快速信号检测的优异的变速器的快速变化。超快滤光轮，UV光固优化的目标，高度敏感的荧光基团和新的CCD相机的Zui新发展使得在高空间分辨率实惠的定量高速活细胞成像。
双波长激发/检测是关键，用于测量荧光团的发射移
如上面所提到的，在比率量度成像的发射偏移仅仅强度变化，而 不是被成像。为了测量发射的变化，荧光团或荧光基团结合的强度的变化，必须使用两个不同的激发波长或者通过检测在两个不同的发射波长的任一测得的。在常用的钙成像染料的fura-2的情况下，该染料具有被激发光在340 nm和380nm处检测波长的波长是510纳米。在对比的是，钙成像染料吲哚-1-通常是激发光在350nm的波长和检测波长为405纳米和485纳米。
图1：使用比例钙指示剂Fura-2从钙成像实验的时间推移的快照。描绘的是经过340纳米（左）和380纳米（中间）的激发和相应的计算出的比率的图像（右）的假色的图像。所述图像系列示出了三个点在时间：在时间的第一点（1）单元，不刺激，细胞内钙离子是在静息水平。在第二时间点（2）的细胞受到刺激和钙是在Zui大水平。在第三时间点（3）的细胞内钙水平下降。在该曲线图在时间上的对应点被标记。上部的曲线示出了340nm处的图像的强度，中间的图中的380nm处的图像和下部曲线图中，显示了比强度。
但是，为什么是必要的双重激发或发射检测？为什么就不能衡量变化的荧光强度？
定，其中荧光团被用于检测改变离子的水平，电压或pH值的实验，发射的荧光的光的强度取决于几个特性。这些将在下面的方程式所描述：
F =荧光强度; C =荧光浓度; D =直径试样（Z轴）; K =光在光路元件的常数（电池特性，目标，过滤器等）; F（X）介绍，如果如离子结合或发生电压/ pH值的变化给定的荧光团的发射行为。
该方程表明，该光强度非常依赖于荧光团的光路中的量。荧光团的光路中的量取决于荧光团在细胞和样品（四）的直径（通过标记的摄取或表达确定的）（多个）的实际浓度（c）在被成像。这使得它很难直接通过简单地观察荧光强度，例如，人们不能状态估计的研究离子，pH值或电压变化的浓度：“100强度等于游离钙在细胞中的100nM的”。试样直径（d），荧光团的浓度（c）和检体和设置（K）的光学特性几乎没有可测量的，但基本上影响整体的强度进行检测。此外，它必须牢记的是，以上所示的公式为真，在检体任何给定的点。随着直径（d）和荧光团浓度（c）是不均质的整个一个试样，甚至在单个细胞，对c和d的值可能是在被检查物的所获取的图像的每一个像素的不同。如果，例如在点“A”，在样品中的细胞的直径是相当高的和游离钙相当低，光强度可能是相同的点“B”，它是相对的。实验者然而，可能错误地推断出钙离子浓度是在这两个地方相似，作为检测到的荧光的光强度是类似的。
图。2：草图以上是想说明，如果在小区内如钙浓度是通过一种非比例钙敏感的荧光团的发射光的强度来判断可能发生的错误解释。草图下面的曲线代表光强度的感兴趣区域（ROI）中的细胞的不同部分的区域。
在上面的图像（A）中的细胞在不同的区室像细胞的突起这往往是不同的厚度（四中的表现公式）精细结构（例如树突和神经元轴突）。作为上述光路内的所有荧光团被激发光激发而其发射的光被收集，小区的较厚部位出现比薄的部分明亮得多。这可能导致的假设，即在细胞中的较厚部分中的钙浓度比可比较薄部分更高，尽管实际的钙浓度是相同的。
在下面的草图（B）不同的情况被示出。在某些细胞类型的荧光团占据的细胞区室之间可能有所不同。在下部草图的情况下，钙浓度（三式中的）中的单元格的更厚的部分较高，但在该领域中的荧光团浓度较低。作为钙敏感染料的检测到的荧光强度不仅依赖于钙离子浓度的细胞，而且还对荧光团浓度，人们可能会得到的印象是，在整个细胞中的钙浓度是相同的。
为了克服这些问题，并为绝对的离子浓度，pH值或电压的精确测量，比例成像已经研制成功。所有比率的方法的共同之处在于，发射的光的强度被测量两次，这些强度的比（R）的计算方法。根据不同的荧光团或所用的荧光团的组合，所述荧光团或者是激发光的两个不同波长和发光强度的测量是在一个波长 - 或荧光团或荧光团的组合是激发光1的波长和发射的测量是在两个不同波长的光。这只是意味着两个灰度值的图像被获取和一比图像从它们算出。两个灰度值的图像通常有不同的强度，但在图像中每一个象素的强度可以通过如下所示的公式来描述：
F =荧光强度; C =荧光浓度; D =直径试样（Z轴）; K =光在光路元件的常数（电池特性，目标，过滤器等）; F（X）介绍，如果如离子结合或发生电压/ pH值的变化给定的荧光团的发射行为。
正如其名称比率成像意味着，对于两个同时获得的图像的每一个像素的比例值来计算。例如，如果非常常用的钙敏感染料的Fura-2（激发在340nm和380nm处）的情况下，所得到的公式将是：
根据简单的数学，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述为：
虚拟图像比例是由两个灰度值图像计算
在实践中，该比例是通过一个计算机在一个时间推移实验计算出的，在许多情况下，联机。通过计算相应的两个独立采集的灰度值的图像的像素的灰度值的比率，该比率图像被创建。请记住，灰度值的图像基本上都是灰度值与相机分辨率的大小或感兴趣区域（ROI）的区域的矩阵（通常是512×512，Zui多不超过1000×1000像素）。在钙成像时间推移实验与染料的Fura-2（激发：340纳米和380纳米，发射：510纳米）这会工作如下（假设该图像具有尺寸3×3个像素）：
执行用于每个图像对中一个时间推移实验的每一个像素这一操作，生成的比值图像栈。Zui后，以假色图可以应用到比图像栈和堆然后可以观看并定量象正常灰度值的时间推移的电影。
除了上面提到的优点，一个比的计算有一个附加的优点。在进行活细胞成像离子，电压或pH敏感的荧光，荧光强度在相应波长的微小变化经常发生。在比成像，但是，强度的增加在一个波长和强度降低，在其它波长是在大多数情况下，观察到的（不管探针是否被激发或用两个波长检测）。如果这两个获得的图像的比例，随后计算，基线和信号振幅之间的差会相对于荧光团的光强度变化被增强。因此，比成像放大检测到的信号的振幅。这是为荧光共振能量转移测定法特别感兴趣，这里的受体蛋白质的下降的荧光强度和能量传输过程中的受体蛋白质的增加的荧光强度。